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   细胞RNA的提取

1.   在培养板中用 PBS液冲洗细胞2次后,加入Trizol裂解细胞,每孔加1ml Trizol6孔板).用取样器反复抽吸混匀,再加入糖原250ug5ul50ug/ul)混匀。注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染。

2.   将样品在15-30℃放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离。

3.   每使用1ml Trizol0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s(注意防止液体溅出),室温放置3min

4.    4 10000rpm离心10-15min样品会分成三层:黄色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%转移到新管中(注意此步骤是决定RNA纯度的关键)。

5.   在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,on ice 放置20min

6.   4 13000rpm离心20min,去上清。

7.   加入1ml 75%乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。

8.   4 10000rpm离心2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。

9.   室温放置晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要,加大约22ulDEPC水)。

10.  2uL RNA液稀释到100uL至于分光光度计下,分光光度计下计算产量。

11.  计算所需要加入的cDNA反应体系中RNA溶液的体积。

 

需要注意的几点,

1.   从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞),加800ul Trizol,后加糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应。

2. 匀浆后,加氯仿前,样品可在-70 ℃放置一个月以上。RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8℃一个星期或-20℃一年以上。如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70 ℃长期保存。

 

预防RNase污染,应注意以下几个方面:

1.  经常更换新手套,因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。

2.  使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。

3.  RNATrizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase

4. 配制溶液应使用无RNase的水(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至中浓度0.1%(v/v),放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之可能,需小心操作)。

 

 

 

 

   反转录

操作方法

1.反转录反应。

SYBR Green Assay


*1  Random 6 mers
Oligo dT Primer同时使用,可有效地将全长 mRNA 反转录成cDNA。使用单引物进行反转录时,使用量分别如下: 

Random 6 mers100 μM    2.0 μl200 pmol

Oligo dT Primer50 μM    0.5 μl25 pmol

Specific Primer2 μM    0.5 μl1  pmol

*2  反应体系可按需求相应放大,10 μl 反应体系可最大使用 1 μgTotal RNA

*3  应用 Gene Specific Primer 时,建议反转录反应条件设置为 4215minPCR 反应有非特异性扩增时,将温度升到50℃会有所改善。

  将得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中,其加入量不要超过 Real TimePCR 反应体积的 1/10V/V)量。

 

 

  Real-Time PCR

 

  

 

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