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试剂和材料:

A.缓冲液和固定剂:

1.含4%的多聚甲醛的PBS(添加镁离子和钙离子)

2TBS缓冲液含0.05%皂苷 250ml

3TBS缓冲液含1%BSA0.05%的皂苷,0.2%的叠氮化钠 100ml

4TBS缓冲液含1%SDS0.05%的皂苷 100ml

B.封片的工具

C.盖玻片用HCI-Alcohol处理,便于细胞的生长

D.载玻片

E.指甲油(封片用)

 

1.  细胞的准备

A)弃去6孔板中培养基

B) PBS冲洗细胞

C) 4%多聚甲醛覆盖盖玻片室温30min(固定)

D)快速的去除多聚甲醛,用TBS漂洗培养皿,每次5min

E) 去除TBS,添加TBS1%SDS0.05%的皂苷溶液,室温5min

F) 去除TBS缓冲液含1%SDS0.05%皂苷溶液,用TBS缓冲液含0.05%皂苷溶液冲洗培养皿4次,每次5min

2.  封闭步骤:

A)去除TBS/0.05%皂苷溶液后,加入TBS缓冲液含1%BSA0.05%皂苷,0.2%叠氮化钠溶液覆盖盖玻片,室温封闭30min

3.  一抗

A)     一抗用TBS1%BSA0.05%皂苷,0.2%叠氮化钠溶液,按照150的比例稀释

B)     标记石蜡膜,这样你就能在石蜡膜合适的地方放置一抗

C)     在先前设计好的石蜡膜的地方放置一滴一抗(20-50ul

D)     小心的移出盖玻片,用吸水纸吸干盖玻片的边缘

E)     倒置盖玻片,使细胞面朝下,把盖玻片放在一抗中,37℃温育30min

F)      TBS1%BSA0.05%皂苷,0.2%叠氮化钠溶液冲洗3次,每次5min

4.二抗(二抗用TBS1%BSA0.05%皂苷,0.2%叠氮化钠溶液,按1:300的比例稀释)

A) 在石蜡膜上设计一个地方,滴入二抗,放置盖玻片在二抗中(细胞面朝下),37℃温育30min

B) TBS1%BSA0.05%皂苷,0.2%叠氮化钠溶液冲洗3次,每次5min

C) 加封片剂到载玻片上

D)放置盖玻片在封片剂上,使细胞面朝下。

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