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细胞培养  cell culture:是在模拟机体内的生理环境中维持细胞生长、繁殖的技术。
一、设施器材
1.设施:超净台、酒精灯、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、干燥箱、冰箱、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。
2.器材:  
2.1 传代培养器材:培养瓶、培养皿、玻璃瓶、刻度吸管、离心管、烧杯、量筒、三角烧瓶 、多孔培养板等。
2.2 原代培养器材 :剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 、纱布、注射器和针头。
二、培养试剂:
培养基、血清(56℃30min灭活)、0.25%胰酶 、PBS(高压灭菌)。
三、实验步骤
1.原代培养:按不同实验需求方法;
2. 细胞传代培养
    2.1准备工作:
      1)肥皂洗手,更换培养室专用工作服。在进行无菌操作前,用75% 的酒精擦拭双手,注意指间和指甲周围。同时,用酒精棉球擦拭超净台,
      2)将培养液放置室温,备用。
      3)打开超净台内的紫外灯,照射30 min。同时,将实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基除外)
      4)倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。
    2.2 关闭超净台的紫外灯,打开风机。
    2.3 点燃酒精灯,取出刻度吸管,在火焰上略烧,然后,安上吸球待用。
    2.4 在打开培养瓶之前,用酒精棉球擦拭瓶盖,打开后,瓶口在酒精灯上过火焰,再用吸管轻轻吸出旧的培养液,注意,吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。
    2.5 用PBS洗细胞2遍,将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察,见到细胞变圆时,立即翻转培养瓶,吸出胰酶。记住不要消化时间过长,(约5-10分钟)。
    2.6 加入含10%血清的培养基终止消化。用吹打管吹打,一定要轻轻吹打,使其从瓶壁上脱落分散到培养基中,再补加培养基,分装到培养瓶中。然后,用火焰烧培养瓶的瓶口和盖,再盖好培养瓶的盖,放到培养箱中进行培养。
    以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法,对于悬浮细胞的传代培养方法,只需要将细胞进行离心,1000 rpm,5 min,然后,换入新的培养基即可。再分装到不同的培养瓶中进行培养。
不健康的细胞质中有空泡,细胞内有颗粒样物质,细胞间空隙增大,变形,不规则,失去原有的特点。
    2.7 是否污染:传代或换液24--48 h注意观察细胞是否被污染,污染的细胞培养液变浑浊,镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢,生长特性改变,胞质内颗粒性物质增多,尽管培养液不变浑浊,考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走,以免污染其它细胞。
3. 细胞冻存与复苏
    3.1 为了保证细胞良好的状态,在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期,同时将细胞换液,次日,按照细胞传代培养方法,用胰酶消化贴壁细胞,将细胞用培养基冲下来,然后,用15 mL离心管离心,1000 rpm,5min,弃上清,收集细胞。
    3.2. 加入适量的冻存液(10% DMSO 和 90%细胞培养液)。
    3.3  分装到冻存管中,做好标记,标明细胞名称,保存时间,细胞代数等。
    3.4  4℃放置30 min;-20℃放置1.5 h; -70℃放置12 h;最后移到液氮罐中长期保存。
4. 细胞的复苏
    细胞的复苏原则是快速溶化,因为如果缓慢的溶化,会使进入细胞的水分形成冰晶,对细胞造成伤害,因此,在复苏细胞时,将冻存细胞直接放到装有75%乙醇的37℃水浴中,使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接加入小培养瓶或培养皿内,然后,加入3 mL的培养液。次日,观察细胞生长情况,并更换细胞培养液。
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