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1. 清洗电转杯,将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时,然后在紫外灯下照射后即可使用。 

2. 电穿孔前一天,以合适密度传代细胞,使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞,一般培养2-3天后,细胞单层融合度可以达到70-80%,即可开始试验。 

3. PBS洗细胞2次,胰酶消化细胞2min,细胞变圆后,用10%血清培养基终止消化。 

4. 轻轻吹下细胞成单细胞悬液后,1200rpm室温离心5min。 

5. 弃上清,加无血清培养基重悬离心。根据细胞数量,加入适量的无血清培养基重悬细胞,并上下吹打均匀。 

注:此时进行细胞计数,使细胞量达到1-3*106cells/ml

6. 加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度(质粒为20ug/mlSiRNA的终浓度为100nM),上下吹打均匀。若以0.5ml计算,所需质粒为0.5×20=10ug。 

7. 将混合液移入相应规格的电转杯中,按照预定条件设置参数,进行电击操作。(不同细胞电转前,需要进行预试验摸索电转的最佳条件,既要保证较高的转染效率,又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出,相应的最佳参数为:质粒:250V10ms1(最多2),04mm cuvette;SiRNA: 250V,5ms1(最多2),04mm cuvette。 

8. 电击完成后,将电转杯置于恒温培养箱中8-12min,以使核酸充分进入细胞。 

9. 将电击杯从恒温培养箱中取出,接种细胞悬液于室温10%培养基中,上下吹打均匀后,置于培养箱中正常培养。 

10. 培养24h后,观察细胞存活状况。

11.48h后,即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。

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